On parlera ici de "risque accru (ou élevé) de mortalité précoce" pour un patient lorsqu'il appartient, dans une cohorte représentative de son état pathologique, à une sous-population dont la médiane de survie est inférieure à celle de la cohorte entière (un exemple de cohorte représentative de patients atteints de cancer du sein métastatique est donné dans la partie expérimentale). Elle vise par ailleurs à identifier un groupe à risque (ne répondant vraisemblablement pas au traitement de référence) pour une pathologie tumorale donnée, afin d'évaluer l'efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques et d'augmenter le rapport bénéfice/risque de candidats médicaments, favorisant ainsi leur approbation clinique.Les cancers solides désignent la multiplication anormale de cellules dans des tissus et/ou des organes "solides" comme le sein ou la prostate, par opposition à la leucémie, un cancer qui touche le sang et la moelle osseuse.Parmi les cancers solides, le cancer du sein est un des plus fréquents. De manière encore préférée, on utilisera une technologie qui permet d'observer au moins 20% des réarrangements théoriques possibles d'un de ces locus (299 réarrangements V-J pour le locus TRB et 2500 pour le locus TRA).L'exemple 5 ci-dessous présente une technologie alternative à la technologie utilisée dans les autres exemples pour mesurer la diversité du répertoire des lymphocytes T. Dans cet exemple, la diversité moléculaire (associant la diversité combinatoire et la diversité du CDR3) est mesurée par séquençage à haut débit d'ADN de PBMC, selon la technique décrite par Robins et al. Par exemple, le Trastuzumab (Herceptin ®) cible le récepteur Her2 (ou CerbB2), qui est un récepteur membranaire permettant d'activer une des voies de la prolifération cellulaire, sur-exprimé dans 25% des cancers mammaires, souvent de mauvais pronostic. (iii) en déduire, dans le cas où le niveau de diversité mesuré à l'étape (i) est inférieur au seuil prédéterminé, que l'individu a un risque élevé de décès précoce.Un exemple particulier de cancer solide pour lequel cette méthode est appropriée est le cancer du sein en phase métatstatique, mais en se basant sur les travaux précédents des inventeurs sur la lymphopénie (Borg et al., 2004; Ray-Coquard et al., 2009) elle peut également être transposée à tous les cancers solides, tels que les cancers de la prostate, du poumon, du côlon, ovariens, de la sphère ORL, les lymphomes, les sarcomes, etc, lorsqu'ils deviennent métastatiques.Bien évidemment, le seuil considéré à l'étape (ii) peut dépendre du profil clinique du patient (type et stade de cancer, et le cas échéant âge et autres paramètres physiologiques), et l'homme du métier est à même de conduire les expérimentations nécessaires, par des études rétrospectives ou prospectives, pour définir un seuil pertinent pour un type de pathologie et/ou de patient donné.De même, la notion de "mortalité précoce" est à rapporter au type de cancer dont est atteint l'individu, ainsi qu'au stade d'avancement de ce cancer (notamment, savoir s'il est métastatique ou non). Eur J Immunol, 39, 2136- 2145.Pannetier, C, Even, J. and Kourilsky, P. (1995) T-cell répertoire diversity and clonal expansions in normal and clinical samples. Numération faible (<1000 Ly^L) et diversité combinatoire faible.Zone 2. Chaque cellule utilise une combinaison de segments géniques selon des règles précises et obtient une chaîne TCR potentiellement unique.Le principe de la recombinaison est basé sur la reconnaissance de séquences RSS spécifiques des gènes V(D)J et l'excision de la région chromosomique intercalée entre les deux gènes réarrangés. Nature, 396, 690-695.Fugmann, S.D., Lee, A.I., Shockett, P.E., Villey, l.J. Cette première étape de génération de diversité définit l'ordre de grandeur du répertoire. Dans le cadre de la présente invention, la mortalité précoce des malades en état de divpénie T correspond typiquement à une espérance de vie deux ou trois fois moindre, voire 5 fois moindre que celle d'une population de malades atteints du même cancer au même stade, sans qu'il soit tenu compte de leur niveau de diversité immunitaire (ou, a fortiori, que celle d'une population de malades atteints du même cancer au même stade, mais ayant une diversité lymphocytaire satisfaisante). Dans ces conditions, la diversité IgH ne permet pas de prédire la survie des patientes atteintes de cancer du sein métastatique.Exemple 3 : Comparaison des coûts estimatifs pour un essai clinique pour tester un traitement innovant pour un cancer solide, avec ou sans sélection des patients selon leur niveau de diversité lymphocytaire Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle, à l'étape (i), l'acide nucléique utilisé est de l'ADN génomique.4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans laquelle la mesure de la diversité combinatoire du répertoire des lymphocytes T est effectuée par des PCR multi-n-plexes avec n>2 à l'aide de combinaisons d'au moins 3 amorces, chaque combinaison d'amorces comprenant au moins les amorces hTRBJl .6 (SEQ ID No : 1), hTRBJ2.7 (SEQ ID No : 2) et une amorce hTRBV choisie dans le groupe constitué des amorces de SEQ ID Nos : 3 à 25.9. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 4506-451 1.Marodon, G., Desjardins, D., Mercey, L., Baillou, C, Parent, P., Manuel, M., Caux, C, Bellier, B., Pasqual, N. and Klatzmann, D. (2009) High diversity of the immune répertoire in humanized NOD.SOD.gamma c-/- mice. Les multiples possibilités thérapeutiques des cancers du sein contrastent avec la difficulté actuelle de déterminer avec fiabilité la population la plus à même de bénéficier d’un traitement adjuvant et la population chez qui la mise en place d’une telle thérapeutique sera génératrice de morbidité, voire de mortalité, de coût pour la société, sans pour autant améliorer son pronostic, et ce, particulièrement, dans la population des patientes sans atteinte ganglionnaire. Cette méthode est basée sur l'analyse ex vivo de la diversité lymphocytaire des patients, à partir d'un échantillon biologique contenant des lymphocytes. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans laquelle le patient est atteint d'un cancer du sein métastatique, et dans laquelle un niveau de diversité des réarrangements V(D)J du locus TRB inférieur à 20% est indicatif d'une espérance de survie du patient inférieure à 6 mois.17. La diversité générée par ce mécanisme est directement dépendante du nombre de combinaisons primaires obtenu lors du réarrangement. 6/6 patientes à diversité <20% sont décédées avec une médiane de survie de 5.21 mois vs. 37/60 décès pour les patientes à diversité >20% avec une médiane de survie de 23.2 mois.Une analyse multivariée confirme les résultats observés en univarié lorsque la divpénie est intégrée dans un modèle de prédiction simple validé (Tableau 2). Une diversité combinatoire hTRB <20% est un facteur indépendant (p-value <0.05) des autre facteurs pronostiques tels que le taux d'hémoglobine, le taux de PNN et la localisation hépatique des métastases. This problem is particularly accurate in node–negative breast cancer patients. Certaines approches mises au point par les immunologistes pour évaluer ces différents niveaux de diversité sont listées ci-dessous selon le principe et le "niveau" de diversité mesurée.- Par cytométrie (Van den Beemd, van Dongen et al. (1999) Unmutated Ig V(H) gènes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Afin de minimiser la quantité nécessaire d'ADN utilisé lors de ces expériences, les PCR doivent être réalisées dans un nombre minimum de tubes. Face à la complexité du système immunitaire, le scientifique aurait besoin de coupler des approches technologiques complémentaires pour décrypter l'ensemble des informations contenues dans le répertoire immunitaire et relevantes d'une pathologie donnée.D'autres méthodes, basées sur l'utilisation de PCR amplifiant spécifiquement des segments d'acides nucléiques caractéristiques de certains réarrangements, ont été décrites. De façon surprenante, ils ont constaté que la divpénie T avait une corrélation directe, forte, avec la mortalité précoce (pas nécessairement par infection), en particulier dans le cas du cancer du sein métastatique (exemple 1). Marqueur prédictif - Définition Un marqueur prédictif est un marqueur qui prédit le bénéfice qu’apportera un traitement But –optimiser l’effiaité ou la tolérane d’un traitement –en identifiant des patients •bénéficiant plus ou moins du traitement •ou à plus ou moins haut risque d’effet indésirable UTILISATION DE LA DIVERSITE COMBINATOIRE DU REPERTOIRE DES LYMPHOCYTES T COMME MARQUEUR PRONOSTIC D'UN CANCER.La présente invention concerne le domaine du pronostic en oncologie. 1B) et est optimum à 20% (Fig.lC). Des molécules de 54 paires de bases sont séquencées puis alignées.Les données de séquence obtenues sont analysées par un algorithme de clustering qui permet de regrouper entre elles des séquences appartenant :A la même combinaison de gènes V-J Il repose sur les cinq armes thérapeutiques que sont la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie, l'hormonothérapie et, plus récemment, l'immunothérapie. 9.Etude des hypermutations somatiques (HMS) :- PCR / séquençage (Hamblin et al., 1999).Mesure indirecte via la décroissance des cercles d'excisions.Si certaines de ces approches ont déjà fait leurs preuves en recherche fondamentale, notamment l'Immunoscope® (Pannetier, C, J. Selon une mise en œuvre particulière de l'invention, illustrée dans l'exemple 1 sur une cohorte de patientes atteintes de cancer du sein métastatique, le seuil considéré à l'étape (ii) du procédé est fixé à 33% ou à 30% de diversité, et l'interprétation à l'étape (iii) consiste à dire que si le niveau de diversité combinatoire des lymphocytes T mesuré est inférieur à ce seuil, l'individu a une espérance de vie deux fois moindre que celle généralement observée pour sa pathologie. Ce marqueur est indépendant de la lymphopénie CD4+ (<450 +ΙμΥ) décrite par Borg C & al. O Scribd é o maior site social de leitura e publicação do mundo. Or, de manière tout à fait intéressante, l'analyse statistique multivariée avec comme référentiel une évaluation du taux de survie à 9 mois indique que la divpénie TRB <20% est un facteur pronostique plus puissant que la mesure des PNN et de la présence de métastases hépatiques. Bien entendu, le résultat obtenu sera d'autant plus informatif que la technologie utilisée permettra l'observation théorique d'un nombre élevé de réarrangements. mécanisme induit une diversité supplémentaire d'un facteur 1000 dans le but d'augmenter les chances de reconnaître un antigène.L'estimation de la diversité issue de l'appariement entre une chaîne TCRa et une chaîne TCRp est obtenue en multipliant le nombre de combinaisons différentes d'une chaîne TCRa, par le nombre de combinaisons possibles pour la chaîne TCRp. Une fois associées aux protéines HMG (High mobility group), les enzymes RAG reconnaissent le nonamère du RSS grâce à leur homéodomaine et induisent une coupure entre le segment de gène V, D, J et l'heptamère, de façon à générer une extrémité codante et une extrémité signal. Méthode selon la revendication 4, dans laquelle la mesure de la diversité combinatoire du répertoire des lymphocytes T dudit individu est effectuée par une méthode permettant d'analyser au moins 10 réarrangements V(D)J du locus TRA ou du locus TRB.6. Méthode selon la revendication 5 ou la revendication 6, dans laquelle la mesure de la diversité combinatoire du répertoire des lymphocytes T dudit individu est effectuée par une méthode permettant d'analyser au moins 70% des réarrangements V(D)J du locus TRB.8. Si ces premiers réarrangements ne sont pas productifs, la cellule a la possibilité de tenter des réarrangements sur son second chromosome, ou encore d'utiliser les gènes V et J disponibles de part et d'autre du premier réarrangement. Une méthode dans laquelle la technologie utilisée à l'étape (i) permet d'analyser au moins 70% des réarrangements V(D)J du locus TRB constitue d'ailleurs un mode de mise en œuvre préféré de l'invention. Les patientes inclues ont reçu les traitements de chimiothérapie classiquement utilisés dans cette pathologie. Cancer Res, 69, 5383-5391.Robins, H. S., Campregher, P.V., Srivastava, S.K., Wacher, A., Turtle, C.J., Kahsai, O., Riddell, S.R., Warren, E.H. and Carlson, C.S. Immunol Today, 16, 176-181.Pham, T., Belzer, M., Church, J.A., Kitchen, C, Wilson, CM., Douglas, S.D., Geng, Y., Silva, M., Mitchell, R.M. Avec une p-value >5% (P=0.2) la diversité combinatoire IgH ne permet pas de prédire le décès précoce chez les patientes métastatiques.Tableau 8 : analyse multivariée de la diversité combinatoire IgH (seuil 50%) en fonction de la survie globale.Ces observations sur la diversité IgH sont valables sur la cohorte étudiée, dans le modèle utilisé, et avec la version de la technologie à la date de l'étude. FR2010/000829.En considérant que le procédé de stratification à l'inclusion est moins cher que le traitement, si sur 100 patients testés par le présent procédé, 15 sont à risque, il sera possible de concentrer l'étude clinique sur les 15 patients plutôt que sur les 100 patients. (1988) T-cell antigen receptor gènes and T-cell récognition. Pour le cancer du sein localisé, le traitement a un objectif curatif. Les conditions de PCR ont été décrites précédemment (Marodon et al., 2009).La description de l'estimation semi-quantitative et qualitative du répertoire est décrite ci-dessous.Attribution des réarrangements : cette attribution consiste à rapprocher la taille des produits de PCR mesurée avec un standard dont la taille et la concentration de chaque produit sont connues. and Stevenson, F.K. Le test ImmunTraCkeR®P est composé de 23 puits (+1 puits pour le contrôle qualité interne), chacun capable de détecter l'ensemble des réarrangements d'une famille V. Ce test permet de détecter 276 réarrangements hTRB V-J différents (276 réarrangements observés correspondraient donc ici à 100% des réarrangements observables). Cette masse, si elle n'est pas dépistée et traitée, peut grossir et donner des métastases.Il existe un grand nombre de traitements disponibles pour le cancer du sein, suivant le stade d'évolution et les paramètres inhérents au patient. Pour le cancer du sein métastatique, il est rare de pouvoir proposer un traitement curatif. La figure 4B présente, pour cette même cohorte, une courbe de survie des patientes en fonction de leur score NDL (correspondant à la zone dans laquelle se trouve leur résultat). Plus particulièrement, il est possible d'établir un seuil de diversité, dépendant de la technologie d'analyse employée et du cancer dont est atteint le malade, en-deçà duquel l'espérance de vie du malade est significativement inférieure à celle, en général, des malades atteints de la même pathologie.1. Cette technologie permet la détection simultanée de plusieurs réarrangements V-J dans la même réaction. Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 1101 1-1 1015.Bonarius, H. P., Baas, F., Remmerswaal, E.B., van Lier, R.A., ten Berge, I.J., Tak, P.P. and de Vries, N. (2006) Monitoring the T-cell receptor répertoire at single-clone resolution. Cette liste n'est pas exhaustive.L'étude du répertoire immunitaire d'une population lymphocytaire a conduit au développement de plusieurs approches multiparamétriques, permettant à la fois de mesurer le niveau de diversité et d'identifier la présence de certains clones T ou B spécifiques. Microbleeds correspond to small areas of hypointense signals on MRI T2 sequences of the brain.. Their presence is correlated with age and hypertension. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer,Oligonucleotides characterized by their use,Pharmacogenomics, i.e. and McCune, J.M. Cette revue va s’intéresser, en particulier, au système uPA/PAI-1, à son rôle biologique et à ses implications cliniques en oncologie mammaire. and Jouvin- Marche, E. (2007) Analysis of the TCR alpha-chain rearrangement profile in human T lymphocytes. Méthode selon la revendication 8, dans laquelle l'analyse est réalisée en effectuant au moins 23 PCR multi-2-plexes, chaque PCR multi-2-plexe étant réalisée avec un triplet d'amorces constitué des amorces hTRBJ1.6 (SEQ ID No : 1), hTRBJ2.7 (SEQ ID No : 2) et d'une amorce hTRBV choisie dans le groupe constitué des amorces de SEQ ID Nos : 3 à 25.10. La transposition des résultats décrits dans la partie expérimentale ci- dessous, par des expérimentations et une analyse statistique de routine, permettra de déterminer un seuil significatif pour la technologie alternative utilisée.Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, illustré expérimentalement ci-dessous, la diversité est mesurée au niveau combinatoire. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, dans laquelle le pronostic est établi en associant au niveau de diversité mesuré à l'étape (i), un ou plusieurs autre(s) paramètre(s) biologique(s) ou clinique(s) sélectionnés parmi la numération lymphocytaire, le nombre de cellules CD4+, le niveau cytokines sériques, le PS {performance status) et le niveau d'hémoglobine.19. Le dosage des taux d’uPA et de PAI-1, au sein du tissu tumoral, fait partie des facteurs décisionnels les plus relevant dans cette situation. Bien évidemment, les réserves exposées plus haut restent pertinentes, et l'homme du métier pourra, sur un type ou un stade différent de cancer, et/ou en utilisant une technologie différente de l'analyse de la diversité combinatoire des réarrangements du locus TRB, ajuster le seuil, de façon à obtenir un seuil de diversité en deçà duquel l'espérance de vie des patients est deux fois moindre que pour les patients atteints de la même pathologie, indépendamment de leur statut immunologique.Selon une autre mise en œuvre particulière de l'invention, également illustrée à l'exemple 1, le seuil considéré à l'étape (ii) du procédé est fixé 25% ou à 20% de diversité, et l'interprétation à l'étape (iii) consiste à dire que si le niveau de diversité combinatoire des lymphocytes T mesuré est inférieur à ce seuil, l'individu a une espérance de vie cinq fois moindre que celle généralement observée pour sa pathologie. 2010/000829,Tableau 1 : amorces s'hybridant au locus TRB (gènes V), utilisables dans le cadre de la présente invention Le cas échéant, l'homme du métier peut choisir d'évaluer la diversité combinatoire du répertoire des lymphocytes T en examinant un nombre plus limité de Les inventeurs, dans la demande de brevet publiée sous le numéro WO 2009/095567, ont décrit plusieurs méthodes de mesure de la diversité combinatoire, selon le(s) locus ciblé(s) (TRA, TRB, TRG, TRD), l'analyse ou non des réarrangements incomplets, le pourcentage, pour chaque locus, de réarrangements analysés (en effectuant un nombre plus ou moins important de PCR), le niveau d'analyse de ces réarrangements (détection du pourcentage de réarrangements ou quantification de chaque réarrangement observé et précisément identifié), etc.Dans le cadre de l'étude expérimentale exposée ci-dessous, la diversité combinatoire du répertoire des lymphocytes T a été évaluée à partir de l'analyse des réarrangements V(D)J du seul locus TRB, par une méthode permettant d'analyser plus de 80% des réarrangements V(D)J du locus TRB. 9.lymphopénie. (Cf. Ce mécanisme d'assemblage, appelé "recombinaison V(D)J", est indépendant d'une cellule à l'autre et permet d'obtenir un seul "fragment" de gène codant pour le TCR. tableau 7 ci-dessous).Tableau 9 : exemple d'hypothèses d'économie réalisée et d'amélioration de la p-value, suite à la stratification à l 'inclusion des patients en fonction de la divpénie mesurée,Exemple 4 : Analyse de la « Numération Diversité Lymphocytaire.La demande WO 2009/095567 décrit (exemple 9) une nouvelle technique de numération, dite « Numération Diversité Lymphocytaire », couplant l'analyse du répertoire immunitaire à la numération du nombre de lymphocytes du patient. and Bjorkman, P.J. "conserver" de la diversité : la diversité jonctionnelle représente le plus grand facteur d'amplification de la diversité du répertoire, mais s'il n'y avait pas le mécanisme de réarrangement secondaire pour sauver 2/3 des thymocytes ayant interrompu leur cadre de lecture, ce bénéfice en terme de diversité représenterait un coût important pour l'organisme, avant même l'étape de sélection positive. Nature, 334, 395-402.Douek, D.C., McFarland, R.D., Keiser, P.H., Gage, E.A., Massey, J.M., Haynes, B.F., Polis, M.A., Haase, A.T., Feinberg, M.B., Sullivan, J.L., Jamieson, B.D., Zack, J.A., Picker, L.J. (1978) Estimation of confidence limits for the cumulative probability of survival in life table analysis. Le principe séquençage est basé sur l'incorporation réversible de nucléotides fluorescents et par lecture optique de la fluorescence.